Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

ASSESSMENT OF FACTORS INNATE IMMUNITY IN DIFFERENT PHASES OF A CURRENT OF CROHN´S DISEASE

Mamedova L.N. 1
1 Rostov Medical State University
Обсуждается роль образраспознающих рецепторов в патогенетических механизмах болезни Крона. Проведена динамическая оценка экспрессии TLR 2,4,6 на моноцитах крови при БК в разные фазы ее течения. Учитывалось изменение экспрессии TLR 2,4,6 в период ремиссии и обострения БК, при различных степенях тяжести, оцениваемых согласно индексу Беста, различной протяженности воспалительного процесса и длительности анамнеза болезни, оценивался микробный пейзаж кишечника. Получены данные о достоверном увеличении количества моноцитов, экспрессирующихTLR 2,4,6, в период рецидива БК, изменении их количества в зависимости от степени тяжести и продолжительности заболевания, а также при нарушении состава микрофлоры кишечника. Выявлена достоверная связь между уровнем моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности TLR 2,4,6 и клиническими маркерами рецидива БК.
The role pattern recognition receptors in the pathogenetic mechanisms of Crohn´s disease. A dynamic assessment expression of TLR 2,4,6 on blood monocytes in CD in different phases of its course. Take into account changes in the expression of TLR 2,4,6 relapseand remission of CD, with varying degrees of severity, assessed according to an index Best, different lengths of the inflammatory process and the long history of the disease, assessed the microbial landscape of the intestine. The data on the reliable increase in the number of monocytes expressing TLR 2,4,6, in the period of recurrence CD, changing their number depending on the severity and duration of the disease, as well as in violation of the intestinal microflora. There was a significant relationship between the level of monocytes expressing on their surface TLR 2,4,6 and clinical markers of recurrence of CD.
6
4
TLR 2
innate immunity
clinical remission
Сrohn´s disease

Болезнь Крона (БК) - гранулематозное воспаление пищеварительного тракта неизвестной этиологии с преимущественной локализацией в терминальном отделе подвздошной кишки, характеризующееся формированием стенозов пораженных участков кишки, образованием свищей, внекишечными проявлениями, сопровождающееся рецидивирующим течением с длительной временной, нередко стойкой нетрудоспособностью и инвалидизацией трудоспособного населения [1, 2, 4]. Согласно последним эпидемиологическим исследованиям, наиболее высокие показатели заболеваемости зарегистрированы в Европе (12,7 на 100000 населения) и в Северной Америке (20,2 на 100000 человек-лет) [2, 4].

Неясная этиология, сложные и не полностью изученные механизмы патогенеза диктуют необходимость дальнейшего изучения указанной патологии. На сегодняшний день не вызывает сомнения полиэтиологичность БК, с акцентом на генетические вариации, аберрации врожденного и адаптивного иммунного ответа, подкрепляемые влиянием качественных и количественных изменений состава кишечной микробиоты и факторов окружающей среды [4]. В настоящее время принципиально важная роль в этиопатогенезе отводится факторам врожденного иммунитета, образраспознающим рецепторам эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, в частности Toll-подобным рецепторам (TLR - Toll-likereceptors) [4, 7]. Способность TLR распознавать TLR сигнальные компоненты, к которым относятся компоненты стенки микробной клетки, сопровождается активацией сигнальных путей, что приводит к созреванию дендритных клеток, продукции цитокинов и запуску адаптивного иммунного ответа [6]. Существует мнение, что в случае нарушения в системе врожденного иммунного ответа гиперактивация TLRs эндогенными лигандами бактерий может быть одним из основных механизмов реактивации хронического воспаления в пораженном сегменте кишки, что закономерно приводит к раннему рецидиву БК [7]. Более того, по мнению Abad C. и соавт. именно нарушения врожденного иммунного ответа играют ключевую роль в патогенезе БК [3].

В зарубежной литературе представлен ряд работ, посвященных изучению TLR у больных с БК. Экспертиза образцов ткани из пораженных участков кишки пациентов выявило повышенное количество TLR 4-экспрессирующих клеток и увеличение экспрессии TLR4мРНК. Несколько независимых исследований подтвердили, что полиморфизм TLR4 связан с БК [7]. Липопролисахариды, являющиеся основным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий, способствуют активации TLR4, что сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов и / или интерферона β [10]. В то же время, некоторые экспериментальные исследования, посвященные изучению других представителей TLRs, показали, что, например, TLR5, взаимодействующий с бактериальным флагеллином или TLR2, вступающий в тесный контакт с липопротеинами грамположительных бактерий, не связаны с прогрессированием болезни Крона [8, 9]. Малочисленные данные о факторах врожденного иммунитета при БК обусловливают перспективность изучения указанного направления при этом заболевании.

Целью данного исследования явилось динамическое определение TLR 2,4,6 у больных с БК в период рецидива и ремиссии заболевания с оценкой возможности их использования в качестве маркеров достижения ремиссии.

Материалы и методы: в исследование включено 19 пациентов с верифицированным диагнозом БК (16 - женщин, 3 - мужчин), средний возраст составил 39,3±2,7 лет. В зависимости от локализации воспалительного процесса в пищеварительной трубке пациенты распределены на 2 группы: 1 группа - 6 (31,6 %) больных с локализацией БК в толстой кишке и 2 группа - 13 (68,4 %) больных с сочетанным поражением толстой и тонкой кишок. Группу контроля составили 20 практически здоровых добровольцев (15 - женщин, 5 - мужчин) в возрасте от 19 до 51 года (средний возраст 26,2±8,3 лет).

Диагноз БК был верифицирован с использованием клинико-лабораторных, иммунологических, эндоскопических и морфологических показателей. Степень активности БК оценивалась с использованием балльного индекса Беста (CDAI) [5]. Оценка дисбиотических нарушений микробиоты толстой кишки проводилась в соответствии с положениями отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [Пр. МЗ РФ от 09.06.2003 № 231].

Экспрессия TLR на моноцитах периферической крови определялась в иммунофлюоресцентном тесте с оценкой процента моноцитов (CD14+ -клеток), несущих на своей поверхности TLR 2,4,6. Для этого проводили поверхностное окрашивание клеток моноклональными антителами (МкАТ), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ), к маркеру моноцитов CD14 (BeckmanCoulter, США) и мышиными моноклональными антителами к TLR2 (СD14+CD282+), TLR4 (СD14+CD284+) и TLR6 (СD14+CD286+), конъюгированными с FITC (изотиоцианатфлуоресцеина) и мечеными PE (фикоэритрин) (HyCultbiotechnology, Голландия). В исследовании также использовали соответствующие изотипические контроли, подготовленные аналогичным образом. Двухцветный анализ проводили на проточном лазерном цитофлюориметре CytomicsFC500 (BeckmanCoulter, США). Экспрессию TLR 2,4,6 и подсчет моноцитов экспрессирующих СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ определяли в фазу рецидива и медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания. На фоне двенадцатинедельной комбинированной базисной терапии фазы клинической ремиссии достигли 5 (26,3 %) больных с БК: 3 (50 %) пациента и 2 (15,4 %) пациента 1 и 2 групп наблюдения соответственно.

Результаты и обсуждение

Для оценки степени тяжести БК использовался индекс Беста, включающий частоту жидкого и кашицеобразного стула в сутки, боль в животе, общее самочувствие, количество осложнений, прием опиатов, наличие инфильтрата в брюшной полости, уровень гематокрита, масса тела больного [5]. В зависимости от тяжести рецидива все больные с БК были распределены на две подгруппы: 6 (31,6 %) пациентов со средней степенью активности и 13 (68,4 %) с высокой степенью тяжести (табл. 1).

Таблица 1.

Характеристика тяжести БК у больных с учетом индекса Беста

Степень тяжести

Количество баллов

Локализация воспалительного процесса

Общее количество больных (%)

1 группа

2 группа

количество больных, %

Легкая

150-300

_

_

_

Средняя

300-450

4 (21,1 %)

2 (10,5 %)

6 (31,6 %)

Тяжелая

>450

2 (10,5 %)

11 (57,9 %)

13 (68,4 %)

Согласно современным представлениям, TLR являются центральным элементом многоуровневой системы распознавания, возбуждение которых сопровождается активацией регуляторных компонентов воспалительного процесса и врожденных механизмов защиты от инфекционных агентов [3]. Мы предполагаем, что это может проявляться увеличением количества моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+.

Таблица 2

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больныхс БК в зависимости от локализации и степени воспалительного процесса

Фаза

Рецидив

Ремиссия

контроль

Локализация

группа 1

группа 2

группа 1

группа 2

 

Степень тяжести

средняя

тяжелая

средняя

тяжелая

средняя

тяжелая

 

Кол-во б-ных

n=4

n=2

n=2

n=11

n=4

n=1

n=20

СD14+CD282+,%

78,3±5,5

79,0±4,7

81,4±3,7*

87,0±4,5*

55,2±3,7

59,0**

66,7±0,8

СD14+CD284+,%

8,0±2,3*

10,1±1,4*

12,3±2,5*

14,7±1,9*

4,8±1,9**

7,0**

3,7±0,3

СD14+CD286+,%

5,5±1,5

5,7±1,1

7,8±1,3*

8,9±2,1*

4,4±1,0**

3,0**

3,4±0,2

Примечание: *- p<0,05 в сравнении с группой контроля, ** - p<0,05 в сравнении с группами в период рецидива заболевания.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, изменение экспрессии СD14+CD282+ по сравнению с показателями группы контроля было наименьшим. Так, статистически значимое увеличение на 14,7 % и 20,3 % было зарегистрировано лишь в группе больных с поражением толстой и тонкой кишок, при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания. Уровень TLR4 СD14+CD284+ изменялся в большей степени. Так, при поражении толстой кишки средней степени активности и тяжелом течении зарегистрировано увеличение количества моноцитов СD14+CD284+ в 2,2 раза и в 2,7 раза соответственно. При сочетанном поражении толстой и тонкой кишок в аналогичных по степени тяжести группах, количество моноцитов, экспрессирующих TLR4, увеличилось в 3,2 и 4,3 раза. Увеличение уровня TLR6СD14+CD286+ в 2,3 и 2,6 раза констатировано при средне-тяжелом и тяжелом течении БК при сочетанной локализации воспалительного процесса (p<0,05).

При достижении медикаментозно индуцированной ремиссии заболевания регистрировалось статистически достоверное снижение экспрессии СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ до значений уровней в группе контроля, что может свидетельствовать о тенденции к нормализации врожденного иммунного ответа (р>0,05).

На следующем этапе настоящего исследования нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR у больных с рецидивом БК, в зависимости от распространённости воспалительного процесса в кишечной стенке.

Как следует из данных, представленных в таблице 3, зарегистрировано наличие сопряженности между увеличением экспрессии TLR и распространенностью воспалительного процесса. Так, при изолированном поражении толстой кишки экспрессия TLR 2 СD14+CD282+ в 1,1 и 1,2 раза превышала значение группы контроля.

Таблица 3

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больных БК в зависимости от распространенности воспалительного процесса

Группа БК

1 группа

2 группа

Контрольная группа

 

n=6 (31,6 %)

n=13 (68,4 %)

n=20

СD14+CD282+, %

74,5±3,1*

82,2±3,1*

66,7±0,8

СD14+CD284+, %

9,4±1,6*

14,4±1,6*

3,7±0,3

СD14+CD286+, %

5,6±0,9*

8,4±1,4*

3,4±0,2

Примечание: * - p<0,05в сравнении с группой контроля.

Увеличение экспрессии TLR6 СD14+CD286+ на поверхности моноцитов было более значимой: констатировано увеличение в 1,6 раз и в 2,5 раза в 1 и 2 группах по сравнению с показателями группы контроля. Максимальное увеличение TLR6 СD14+CD284+в 2,5 и 3,5 раза зарегистрированов 1 и 2 группах наблюдения (p<0,005).

Таблица 4

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ в зависимости от длительности заболевания

Количество больных

Впервые

n=3

1-10 лет

n=8

Более 10 лет

n=8

СD14+CD282+

75,3±4,7

81,1±5,1

83,1±2,1*

СD14+CD284+

7,5±1,9*

11,8±1,8*

15,8±2,1*

СD14+CD286+

3,1±1,5

6,9±1,3*

8,9±1,1*

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой контроля.

Учитывая выявленную закономерность, нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR 2, 4, 6 и длительности БК. Результаты, представленные в таблице 4, наглядно демонстрируют однонаправленные изменения экспрессии TLR2 СD14+CD282+, TLR 4 СD14+CD284+ и TLR 6 4СD14+CD286+ у больных с БК в зависимости от длительности заболевания. Уровень моноцитов СD14+CD282+ и СD14+CD286+ у больных с впервые выявленным заболеванием и при длительности болезни до 1 года составил 75,3±4,7 % и 3,1±1,5 % и практически не отличался от значений группы контроля (р>0,05). Тенденция к увеличению количества моноцитовв 1,2 и в 2 раза зарегистрирована в диапазоне длительности болезни от 1-10 лет и более 10 лет (р<0,05). Максимальное увеличение TLR 2 и 6 зафиксировано при длительности БК более 10 лет: 83,1±2,1 % и 8,9±1,1 % соответственно, что превышало значения в группе контроля в 1,2 и 2,6 раза соответственно (р<0,05). При оценке прироста моноцитов, отражающих экспрессию TLR4, зарегистрирована аналогичная динамика изменений. Так, у больных с впервые выявленным заболеванием увеличение CD14+CD284+ превышало значения группы контроля в 2 раза, а при длительности заболевания более 10 лет, количество моноцитов составило 15,8±2,1 %, что в 4,3 раза превышало контрольные значения (р<0,05).

Учитывая выявленную зависимость между количеством моноцитов, экспрессирующих TLR2 СD14+CD282+, TLR4 СD14+CD284+ и TLR6 4СD14+CD286+, длительностью и активностью БК, был проведен корреляционный анализ. Результаты демонстрируют наличие прямой корреляции между экспрессией СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ и частотой дефекации (r=039,r=0,47, r=0,45 соответственно, при р<0,05), наличием патологических примесей в кале (r=0,64, r=0,55, r=0,60, при p<0,05), интенсивностью абдоминального болевого синдрома (r=0,72, r=0,57, r=0,60 соответственно, при p<0,05).

В настоящее время не утратила своего значения инфекционная теория возникновения ВЗК. В клинических исследованиях установлено, что у большинства больных с БК в период обострения заболевания регистрировались нарушениями микробиоты в виде изменения количественного и качественного состава микрофлоры кишечника. Результаты немногочисленных клинических исследований свидетельствуют о наличии при ВЗК детерминированной реакции иммунной системы на собственную микрофлору кишечника [8, 10].

Данные, представленные в таблице 5, демонстрируют наличие дисбиотических нарушений у всех больных в период рецидива заболевания. При достижении клинической ремиссии нарушения микробиоты толстой кишки зарегистрированы лишь 4 (21 %) случаях и характеризовались уменьшением количества бифидобактерий до 107-106 (КОЕ/г) илактобактерий до 105-104 (КОЕ/г). При проведении внутригруппового анализа между уровнем моноцитов CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ и степенью дисбиотических изменений толстой кишки зарегистрировано наличие прямой зависимости (p<0,005). Так, количество CD14+CD284+иCD14+CD286+ при III степени дисбиотических расстройств составило 13,1±0,7 % и 10,2±0,7 %, что превышало уровень моноцитов у больных с I степенью в 1,7 и 1,5 раза. Зарегистрированные изменения позволяю высказать предположение о наличии реакции TLR4 и 6 с собственной измененной микробиотой толстой кишки.

Таблица 5

Показатели экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ у больных БК, имеющих нарушения в составе микрофлоры кишечника

Количество больных

I степень

n=4

II степень

n=7

III степень

n=8

Группа контроля

n=20

CD14+CD282+,%

76,3±3,0

81,5±2,8

85,6±3,9

66,7±0,8

CD14+CD284+,%

7,8±0,8

11,6±1,1

13,1±0,7*

3,7±0,3

CD14+CD286+,%

6,7±0,4

9,3±0,4

10,2±0,7*

3,4±0,2

Выводы:

  1. У больных с рецидивом БК выявлено увеличение количества моноцитов в периферической крови, ответственных за экспрессию CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+.
  2. Увеличение экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ находится в прямой зависимости от фазы воспалительного процесса и длительности БК. При достижении медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания регистрируется статистически достоверное снижение количества моноцитов, экспрессирующих CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+.
  3. Зарегистрировано наличие прямой зависимости между увеличением экспрессии CD14+CD284+ и CD14+CD286+ и степенью дисбиотических нарушений толстой кишки в периодрецидива БК.
  4. Выявлена достоверная прямая корреляционная связь между уровнем моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ и клиническими маркерами рецидива БК.
  5. Снижение экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ на фоне базисной терапии БК может являться интегральным показателем отражающим достижение клинической ремиссии заболевания.

Рецензенты:

Погорелова Т. Н., д-р биол. наук, профессор, зав. отделом медико-биологических проблем ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России, г. Ростов-на-Дону.

Яковлев А. А., д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС РостГМУ, г. Ростов-на-Дону.