Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

DEVELOPMENT OF METHODS OF DETECTION AND ISOLATION CLOZAPINE AND OXAZEPAME MODEL MIXTURE URINE

Remezova I.P. 1 Lazaryan D.S. 1 Maksimenko T.I. 1 Likhota T.T. 1
1 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of the «Volgograd state medical University» of the Ministry of health of the Russian Federation
Предварительно были разработаны методики изолирования, идентификации и количественного опреде-ления клозапина и оксазепама в растворах. Разработаны методики изолирования клозапина и оксазе-пама из модельных смесей мочи. Предложены условия идентификации клозапина и оксазепама в извле-чениях из мочи и их последующая дифференциация между собой с помощью тонкослойной хроматогра-фии и УФ-спектрофотометрии. Изучена возможность использования общих и частных систем раствори-телей для обнаружения клозапина и оксазепама методом ТСХ. Разработаны условия количественного определения клозапина и оксазепама методом УФ-спектрофотометрии после очистки с помощью метода ТСХ. Расчет количественного содержания изучаемых веществ проводили по их удельному показателю поглощения. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: прецезион-ность, правильность, линейность и предел количественного определения. Предложенные методики мо-гут быть включены в схему химико-токсикологического анализа изучаемых лекарственных веществ.
Previously there have been developed methods of isolation, identification and quantitative determination of clozapine and oxazepamе in solutions. The methods of isolation of clozapine and oxazepamе of modelling of mixtures of urine. Proposed conditions for the identification of clozapine and oxazepamе in extracts of urine and their subsequent differentiation among themselves by means of thin-layer chromatography and in the UV spectrophotometry. Possibility of use of public and private systems dissolve teachers for the detection of clozapine and oxazepamе by TLC. Developed conditions for the quantitative determination of clozapine and oxazepamе by UV spectrophotometry after cleaning with the help of the method of TLC. Calculation of the quantitative content of studied substances was carried out according to their specific index of absorption. Validation assessment methods developed conducted by the indicators precision, accuracy, linearity and the limit of quantification. The proposed methods may be included into the scheme of chemical-toxicological analysis of the studied drugs.
the analysis
poisonings
oxazepame
clozapine

УДК [615.214.22.015.21.099.074:616.008.84]:543

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИЗОЛИРОВАНИЯ И ОБНАРУЖЕНИЯ КЛОЗАПИНА И ОКСАЗЕПАМА В МОДЕЛЬНОЙ СМЕСИ МОЧИ

Ремезова И. П., Лазарян Д. С., Максименко Т. И., Лихота Т. Т.

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» Минздрава РФ, Пятигорск, Россия, (375500, Пятигорск, пр. Калинина-11), e-mail:irinaremezova@rambler.ru

Предварительно были разработаны методики изолирования, идентификации и количественного определения клозапина и оксазепама в растворах. Разработаны методики изолирования клозапина и оксазепама из модельных смесей мочи. Предложены условия идентификации клозапина и оксазепама в извлечениях из мочи и их последующая дифференциация между собой с помощью тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии. Изучена возможность использования общих и частных систем растворителей для обнаружения клозапина и оксазепама методом ТСХ. Разработаны условия количественного определения клозапина и оксазепама методом УФ-спектрофотометрии после очистки с помощью метода ТСХ. Расчет количественного содержания изучаемых веществ проводили по их удельному показателю поглощения. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: прецезионность, правильность, линейность и предел количественного определения. Предложенные методики могут быть включены в схему химико-токсикологического анализа изучаемых лекарственных веществ.

Ключевые слова: анализ, отравления, оксазепам, клозапин.

DEVELOPMENT OF METHODS OF DETECTION AND ISOLATION CLOZAPINE AND OXAZEPAME MODEL MIXTURE URINE

Remezova I. P., Lazarjan D. S., Maksimenko T. I., Likhota T. T.

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute – branch of the «Volgograd state medical University» of the Ministry of health of the Russian Federation, Pyatigorsk, Russian (375500, Pyatigorsk, Kalinina str.-11), e-mail:irinaremezova@rambler.ru

Previously there have been developed methods of isolation, identification and quantitative determination of clozapine and oxazepamе in solutions. The methods of isolation of clozapine and oxazepamе of modelling of mixtures of urine. Proposed conditions for the identification of clozapine and oxazepamе in extracts of urine and their subsequent differentiation among themselves by means of thin-layer chromatography and in the UV spectrophotometry. Possibility of use of public and private systems dissolve teachers for the detection of clozapine and oxazepamе by TLC. Developed conditions for the quantitative determination of clozapine and oxazepamе by UV spectrophotometry after cleaning with the help of the method of TLC. Calculation of the quantitative content of studied substances was carried out according to their specific index of absorption. Validation assessment methods developed conducted by the indicators precision, accuracy, linearity and the limit of quantification. The proposed methods may be included into the scheme of chemical-toxicological analysis of the studied drugs.

Key words: the analysis, poisonings, oxazepame, clozapine.

Введение. Результативность сочетанного назначения клозапина и других антипсихотических препаратов является предметом давнего и пристального внимания специалистов.

Отчасти это связано с тем, что клозапин, в отличие от других атипичных антипсихотиков, применяется в клинической практике уже около 20 лет, но также и потому, что он был признан за это время антипсихотическим препаратом резерва [8]. Основанием для такой комбинации было представление, что не для всех больных монотерапия клозапином является достаточной для купирования продуктивной психотической симптоматики. В различных западных странах, а также и в нашей стране, более 50 % больных, принимающих клозапин, дополнительно получают еще и антипсихотические препараты других групп [3], например, бензодиазепины [1]. Поэтому целью настоящего исследования явилась разработка схемы химико-токсикологического анализа клозапина с оксазепамом в моче.

Материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение. Предварительно нами были разработаны методики изолирования, идентификации и количественного определения клозапина и оксазепама в растворах. Изолирование клозапина [2, 7, 11] и оксазепама [11] проводили хлороформом как наиболее оптимальным растворителем для обоих веществ при рН=10-11. Для обнаружения изучаемых лекарственных веществ при совместном присутствии использовали метод ТСХ. В работе применяли готовые пластины «Сорбфил». В качестве подвижных фаз использовали следующие системы растворителей, наиболее часто применяемые в скрининге лекарственных веществ основного характера при ненаправленном анализе (таблица 1).

Таблица 1. Значения Rf исследуемых лекарственных веществ в общих

хроматографических системах (n=6)

Исследуемое вещество

Системы растворителей

толуол- ацетон- спирт 96% - 25% раствор аммиака

(45: 45: 7,5: 2,5)

хлороформ- метанол (100:10)

метанол- 25% раствор аммиака (100: 1,5)

Клозапин

0,62

0,42

0,53

Оксазепам

0,81

0,82

0,80

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальное разделение клозапина и оксазепама наблюдается в системе хлороформ- метанол (100:10).

Так же исследовали возможность применения частных систем растворителей, используемых при испытании субстанции, таблеток и растворов для инъекций клозапина на посторонние примеси [4, 5, 9, 10], субстанции оксазепама [6] (таблица 2).

Таблица 2. Значения Rf исследуемых лекарственных веществ в частных

хроматографических системах (n=6)

Исследуемое вещество

Системы растворителей

бензол- спирт 96%- 25% раствор аммиака

(50: 10: 0,5)

этилацетат- хлороформ- 25% раствор аммиака (85: 10: 5)

толуол-ацетон-25% раствор аммиака (50:50:1)

этилацетат-25% раствор аммиака- уксусная кислота (26:1,6:3,3)

этилацетат-дихлорэтан- 25% раствор аммиака (80:20:5)

Клозапин

0,51

0,53

0,52

0,65

0,55

Оксазепам

0,87

0,81

0,80

0,67

0,57

В системах бензол- спирт 96 %-25 % раствор аммиака (50: 10: 0,5), этилацетат- хлороформ- 25% раствор аммиака (85: 10: 5), толуол-ацетон-25% раствор аммиака (50:50:1) наблюдается хорошее разделение клозапина и оксазепама. Системы бензол- спирт 96%- 25% раствор аммиака (50: 10: 0,5) и этилацетат- хлороформ- 25% раствор аммиака (85: 10: 5) целесообразно использовать для очистки клозапина и оксазепама от соэкстрактивных веществ извлечений из биологических объектов.

Для разработки методик идентификации и количественного определения клозапина с помощью УФ спектрофотометрии готовили раствор клозапина в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. Полученный спектр раствора (10 мкг/мл) характеризуется наличием максимумов при длинах волн 245±2 нм и 297±2 нм, что совпадает с данными литературы [11]. Расчет содержания клозапина проводили по удельному показателю поглощения, определенному в экспериментальных условиях и равному 911. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: прецезионность, правильность, линейность и предел количественного определения (таблица 3).

Таблица 3. Результаты оценки прецезионности и правильности

спектрофотометрического определения клозапина

№ п/п

Внесено, г

Найдено, г

R, %

Метрологические характеристики

1

0,0511

0,05138

100,5

 

=0,0516 г

SD=0,0005

RSD=0,97%

=100,15%

 

2

0,0522

0,05221

100,02

3

0,0523

0,05220

99,81

4

0,0512

0,05134

100,3

5

0,0517

0,05168

99,96

6

0,0509

0,05105

100,3

Относительное стандартное отклонение не превышает 1 % при значении открываемости 100,15±0,27 %. Поскольку рассчитанный критерий Стьюдента (1,22) меньше табличного (2,57), результаты не отягощены систематической ошибкой. Предел количественного определения клозапина устанавливали с помощью метода «десяти сигма», который составил 0,0006 г/100 мл. Линейная зависимость наблюдается в области концентраций клозапина от 4 до 14 мкг/мл.

Для разработки методик идентификации и количественного определения оксазепама с помощью УФ спектрофотометрии готовили раствор оксазепама в спирте 96 % . Полученный спектр характеризуется наличием максимумов при длине волны 229±2 нм (4 мкг/мл) и 316±2 нм (40 мкг/мл), что совпадает с данными литературы [6, 11]. Для количественного определения оксазепама нами была использована длина волны 316 нм.

Расчет количественного содержания проводили по удельному показателю поглощения оксазепама, определенному в экспериментальных условиях и равному 165,4. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: прецезионность, правильность, линейность и предел количественного определения (таблица 4).

Таблица 4. Результаты оценки прецезионности и правильности

спектрофотометрического определения оксазепама

№ п/п

Внесено, г

Найдено, г

R, %

Метрологические характеристики

1

0,0210

0,02088

99,43

= 0,021 г

SD=0,0002

RSD=0,95%

=100,04%

 

2

0,0212

0,02127

100,3

3

0,0213

0,02122

99,6

4

0,0208

0,02085

100,2

5

0,0207

0,02079

100,4

6

0,0212

0,02126

100,3

Относительное стандартное отклонение не превышает 1 % при значении открываемости 100,04±0,43 %. Поскольку рассчитанный критерий Стьюдента (1,25) меньше табличного (2,57), результаты не отягощены систематической ошибкой. Предел количественного определения оксазепама устанавливали с помощью метода «десяти сигма», который составил 0,0014 г/ 100 мл. Линейная зависимость наблюдается в области концентраций оксазепама от 10 до 60 мкг/мл.

При идентификации и количественном определении изучаемых лекарственных веществ в извлечениях из мочи важным условием является выбор рН среды. Значения рКа1 и рКа2 клозапина составляет 1,5; 10,5, а рКа1 и рКа2 оксазепама – 1,7; 11,6 соответственно [11]. Методика анализа: к 25 мл мочи добавляли спиртовый раствор, содержащий 2 мг клозапина и 82,5 мг оксазепама (концентрации веществ соответствуют минимальной терапевтической дозе, исходя из среднесуточного объема мочи 1500 мл). Полученную модельную смесь оставляли на 24 часа при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 25 % раствор аммиака до рН=10-11 и экстрагировали трехкратно хлороформом объемом по 10 мл. После каждой экстракции отделяли слой органического растворителя от водной фазы. Полученные органические извлечения объединяли и исследовали.

Обнаружение и клозапина и оксазепама в извлечениях из мочи проводили методом ТСХ в оптимальной системе растворителей: бензол-спирт 96 %-25% раствор аммиака (50: 10: 0,5). Затем с целью очистки от эндогенных примесей проводили элюирование изучаемых лекарственных веществ с хроматографической пластины.

Зону адсорбции клозапина элюировали 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты. Спектр поглощения полученного раствора измеряли в области 200-300 нм с помощью спектрофотометра в кюветах с длиной рабочего слоя 10 мм относительно раствора сравнения (извлечение из контрольного опыта без добавления клозапина и оксазепама). Спектр извлечения характеризуется наличием максимума при длине волны 242±2 нм. В извлечениях из контрольной пробы мочи максимумов поглощения не наблюдали. Результаты количественного определения клозапина в извлечении из мочи представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты количественного определения клозапина в

извлечениях из мочи методом УФ спектрофотометрии

Внесено, мкг/мл

Обнаружено, мкг/мл

Метрологические характеристики

80,0

62,2

=65,50 мкг/мл

SD=2,0842

RSD=3,18%

а=65,50±2,19

80,0

67,8

80,0

65,7

80,0

67,2

80,0

64,0

80,0

66,1

Предложенная методика позволяет определить 65,5±2,19 мкг/мл клозапина, что составляет 81,88 % при относительном стандартном отклонении 3,18 %.

Зону адсорбции оксазепама с хроматографической пластины элюировали спиртом 96 %. Измеряли спектр полученного раствора в области 220–300 нм и 280–380 нм с помощью спектрофотометра в кюветах с длиной рабочего слоя 10 мм относительно раствора сравнения (извлечение из контрольного опыта без добавления клозапина и оксазепама). Спектр поглощения извлечения характеризуется наличием максимума при длине волны 228±2 нм и 315±2 нм. В извлечениях из контрольной пробы мочи максимумов поглощения не наблюдали. Результаты количественного определения оксазепама в извлечении из мочи представлены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты количественного определения оксазепама

в извлечениях из мочи методом УФ спектрофотометрии

Внесено, мг/мл

Обнаружено, мг/мл

Метрологические характеристики

3,3

2,47

=2,29 мг/мл

SD=0,1475

RSD=6,44%

а=2,29±0,16

3,3

2,06

3,3

2,23

3,3

2,39

3,3

2,35

3,3

2,21

Предложенная методика позволяет определить 2,29±0,16 мг/мл оксазепама, что составляет 69,39 % при относительном стандартном отклонении 6,44 %.

Выводы. Таким образом, предложена методика изолирования клозапина и оксазепама из мочи при рН=10-11. Изучена возможность использования общих и частных систем растворителей для обнаружения клозапина и оксазепама. Обнаружение клозапина и оксазепама в извлечениях из мочи предложено проводить методом ТСХ в системе растворителей: бензол- спирт- 25 % раствор аммиака (50: 10: 0,5). Предложена методика количественного определения клозапина и оксазепама методом УФ спектрофотометрии после очистки с помощью метода ТСХ, которая может быть включена в схему химико-токсикологического анализа изучаемых лекарственных веществ.

 

Рецензенты:

Оганесян Эдуард Тоникович, д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» Минздрава РФ, г. Пятигорск.

Попова Ольга Ивановна, д.фарм.н., профессор кафедры фармакогнозии, Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» Минздрава РФ, г. Пятигорск.