Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

EXTRACTS OF THE PHYTOGENESIS INHIBIT REPRODUCTION OF INFLUENZA A FOR CELL CULTURE MDCK

Makarevich E.V. 1 Filippova E.I. 1
1 State Research Center of Virology and Biotechnology Vector
С целью выявления перспективных лекарственных средств было проведено исследование токсичности и противовирусной активности водных и этанольных экстрактов из высших растений (Radices Hedysari theini, копеечник чайный и Herba Astragali dasyanti, астрагал шерстистоцветковый) на перевиваемой линии клеток MDCK. Важно, что лекарственное растительное сырье является наиболее дешевым и доступным источником получения лекарственных средств. Установлено, что исследованные образцы водных и этанольных экстрактов копеечника чайного и астрагала шерстистоцветкового малотоксичны на культуре клеток MDCK. Изучение противовирусной активности экстрактов из этих растений на культуре клеток MDCK в профилактической схеме показало, что исследованные образцы подавляют размножение вируса гриппа А на 1,5 – 2,8 lg. Наибольшую противовирусную активность проявил этанольный экстракт из копеечника чайного.
In order to identification perspective medicines were investigated with respect to their toxicity and antiviral activity of water and etanolny extracts from the highest plants (Radices Hedysari theini, Herba Astragali dasyanti) for cell culture MDCK. It,s very important that medicinal plant raw materials is the cheapest and available source of receiving medicines.All investigated specimens plant extracts were low-toxicity for cell culture MDCK. It was shown that water and etanolny extracts from the highest plants inhibited reproduction influenza A about 1,5 – 2,8 lg in preventive scheme for cell culture MDCK. The largest antiviral activity was showed etanolny extract from the plant Herba Astragali dasyanti.
the highest plants
toxicity
water and etanolny extracts
cell culture MDCK
antiviral activity.

Введение

Использование растений в качестве лекарств пришло в наш век из глубокой древности и до сих пор играет значительную роль в арсенале лекарственных средств современной медицины. Это обусловлено некоторыми преимуществами препаратов фитотерапии по сравнению с синтетическими лекарствами.

Одним из основных преимуществ растительных лекарств является низкая частота побочных явлений. Интерес к фитотерапии вызван также изменением в современном мире возрастной структуры населения, а именно – увеличением лиц пожилого возраста, которые, как правило, страдают хроническими заболеваниями, требующими длительного применения лекарственных средств, и риск развития побочных явлений при этом должен быть минимальным. Особую роль фитотерапия занимает в педиатрической практике, так как лекарственные растения действуют мягче и реже дают нежелательные осложнения.

Низкую частоту побочных явлений можно объяснить тем, что растительное лекарство – это комплекс, включающий в себя биологически активные вещества (БАВ): протеины, микроэлементы, витамины, эфирные масла и многие другие, который, по существующему мнению, сформировавшись в живой клетке, имеет большее сходство с человеческим организмом, чем изолированное, химически чистое действующее вещество, в связи с чем, он легче ассимилируется и дает меньше побочных эффектов [5].

Очень велики возможности комплексного применения лекарственных средств растительного происхождения, так как лекарственные растения в своем большинстве совместимы между собой и другими лекарственными веществами, и при сочетании лекарственных растений часто проявляется синергизм их действия.

Необходимо отметить, что лекарственное растительное сырье является наиболее дешевым и доступным источником получения лекарственных средств [5].

В настоящее время в качестве лекарственного сырья широко используются высшие растения, среди которых особое внимание привлекают копеечник чайный и астрагал шерстистоцветковый. Так известно, что настой из астрагала шерстистоцветкового используется для лечения начальных форм гипертонической болезни, недостаточности кровообращения I и II степеней, а также при острых гломерулонефритах на ранней стадии болезни. Из этой травы получен экстракт в таблетках «Мукалтин», основным действующим веществом которого являются тритерпеновые сапонины, производные дазиантогенина и флавоноидные гликозиды [2]. Другое растение, копеечник чайный или красный корень, содержит дубильные вещества, ксантон хедизарид, тритерпеновые сапонины, кумарины, флавоноиды, свободные аминокислоты и обладает противовоспалительным, сосудорасширяющим, антиоксидантным и общетонизирующим действием [1].

Целью данной работы было изучение в культуре клеток MDCK противогриппозных свойств водных и этанольных экстрактов, выделенных из высших растений копеечника чайного и астрагала шерстистоцветкового.

Материалы и методы

Экспериментальные образцы экстрактов. В работе использовали водные и этанольные экстракты из высших (Radices Hedysari theini, копеечник чайный и Herba Astragali dasyanti, астрагал шерстистоцветковый) растений, полученные под руководством профессора Трошковой Г. П. и сотрудников, как описано ранее [3].

Культура клеток. Для определения токсичности и противовирусной активности экстрактов использовали перевиваемую линию клеток почки собаки кокер-спаниеля MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточную суспензию разводили предварительно подогретой до температуры 37 ºC средой RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», г. Санкт-Петербург), содержащей 10 % сыворотки крови плодов коровы (ООО «БиолоТ», г. Санкт-Петербург), до концентрации 1,0– 1,5×105 клеток/мл и вносили по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Затем планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37 ºC, 5% СО2 и 100 % влажности на 2–3 сутки до образования клеточного монослоя.

Вирусы. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и адаптированный к лабораторным мышам штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанные на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Инфекционный титр штаммов вируса гриппа выражали в ТЦД50/мл (пятидесятипроцентная тканевая цитопатическая доза) [4].

Определение токсичности экстрактов in vitro. Для определения токсических концентраций образцы экстрактов из высших растений разводили в несколько раз (в 2, 5, 10, 100, 1000, 10000 раз) средой RPMI-1640, содержащей 5 % сыворотки крови плодов коровы, вносили в монослой клеток MDCK по 100 мкл/лунку планшета и помещали в термостат при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности на двое суток. Через 2-е суток оценивали наличие или отсутствие токсического действия растительных экстрактов на монослой клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа [4].

Определение противовирусной активности экстрактов in vitro. В исследованиях по определению противовирусной активности экстрактов использовали их максимально переносимые концентрации (МПК). Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности растительных экстрактов в профилактической схеме в монослой культуры клеток MDCK вносили образцы в объеме 50 мкл/лунку в максимально переносимой концентрации, после инкубирования клеток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2 в течение 1 ч вносили разведения вируссодержащей жидкости в объеме 50 мкл/лунку и вновь инкубировали клетки в течение 2–3 суток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2. По окончании инкубирования клеток регистрировали цитопатическое действие вируса (ЦПД) в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1 % эритроцитами петуха [4].

Результаты и обсуждение

Цитотоксическое действие экстрактов на клетки MDCK. Установлено, что 50 %-я цитотоксическая доза (ТС50) экстрактов, полученных из высших растений, составляла от 0,05 до 1,0 мг/мл для разных образцов (таблица).

Таблица

Противовирусная активность водных и этанольных экстрактов высших растений в клетках MDCK, зараженных вирусом гриппа А (профилактическая схема)

 

Образец

Концентра-

ция

сухого

вещества

в экстракте, мг/мл

Токсич-

ность

для клеток MDCK (ТС50),

мг/мл

Инфекционность вируса (титр)

в клетках MDCK в lg ТЦД50/мл

(М±m, n=3)

Индекс нейтрализации

(Титр контроль - Титр опыт), lg

 

Наиме-нование

 

А/Aichi/2/68*

А/chiken/

Kurgan/

05/2005®

А/Aichi/2/68

А/chiken/Kurgan/05/2005

 

Herba Astragali dasyanti

21 W♠

5,0

0,05

4,3±0,5

6,3±1,1#

0

1,5

 

Radices Hedysari theini

22 E♥

5,0

1,0

1,5±0,7#

7,8±1,0

2,8

0

 

 

Примечание: М – среднее арифметическое, m – ошибка среднего, * титр вируса А/ Aichi/2/68 в контроле составлял 4,3±0,5 lg ТЦД50/мл; ® титр вируса A/chiken/Kurgan/05/2005 в контроле составлял 7,8±1,0 lg ТЦД50/мл; # отличие от титров в контроле по t-критерию Стьюдента при р≤0,05; n-число экспериментов; ♠ – водный экстракт♥ – этанольный экстракт.

Изучение протективных свойств растительных экстрактов в отношении вируса гриппа А in vitro. Для оценки противовирусной активности растительных экстрактов в опытах in vitro использовали их нетоксические концентрации. Данные противовирусной активности экстрактов на клетках MDCK в отношении вируса гриппа А представлены в таблице. Как видно из таблицы, водный экстракт высшего растения астрагала шерстистоцветкового (Herba Astragali dasyanti) ингибирует размножение вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (индекс нейтрализации (ИН) составляет 1,5 lg), но не подавляет размножение вируса гриппа человека А/Aichi/2/68 (H3N2). При этом этанольный экстракт, полученный из этого же растения, в экспериментах in vitro не подавляет репродукцию ни вируса гриппа птиц, ни вируса гриппа человека (данные не приведены).

Исследование водного и этанольного экстрактов другого представителя высших растений – копеечника чайного (Radices Hedysari theini) показало, что только его этанольный вариант проявляет противовирусную активность и только в отношении вируса гриппа человека субтипа A(H3N2) (ИН штамма А/Aichi/2/68 составляет 2,8 lg) (таблица). Водный же экстракт копеечника чайного сколь-нибудь заметной противогриппозной активности в отношении вирусов гриппа субтипов A/H5N1 и A/H3N2 не обнаруживают (данные не приведены). На основании полученных данных можно предположить, что для подавления репродукции вирусов гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в культуре клеток MDCK необходимы разные биологически активные вещества (БАВ) или их композиции.

Заключение

Полученные результаты по противовирусной активности экстрактов высших растений копеечника чайного и астрагала шерстистоцветкового открывают возможность разработки новых противогриппозных препаратов на основе этого растительного сырья. При этом важно, что экстракты, обнаружившие противовирусную активность в отношении штаммов вируса гриппа человека и птиц, обладают низкой токсичностью для эукариотических клеток.

Детальное изучение химического состава, фармакологических свойств, а также доклинических и клинических испытаний БАВ (и/или композиций БАВ) из этих растений позволят разработать и внедрить в практику здравоохранения новые эффективные растительные препараты на их основе против вируса гриппа.

Рецензенты:

Шишкина Л. Н., д.б.н., заведующая отделом профилактики и лечения особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.

Белявская Валентина Александровна, д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.