Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

DNA MARKERS FOR RESISTANCE TO DOWNY MILDEW (PLASMOPARA HALSTEDII) IN WILD SUNFLOWER

Usatov A.V. 1 Azarin K.V. 1 Tikhobaeva V.E. 1 Volichenko M.I. 1 Gavrilova V.A. 2 Markin N.V. 1
1 Southern Federal University
2 N. I. Vavilov Research Institute of Plant Industry
Проведен поиск новых доноров генов устойчивости к ложной мучнистой росе (Plasmopara halstedii) среди однолетних и многолетних видов рода Helianthus L. Показано, что при идентификации локуса устойчивости Pl6 у однолетних видов информативным является маркер НаР2 (фрагмент 1200 п.н.), в то время как у многолетних видов – НаР3 (фрагмент 1800 п.н.). В то же время необходимо отметить, что в большинстве случаев у многолетних видов результаты амплификации ДНК с праймером НаР2 совпадают с результатами ПЦР-анализа с праймером НаР3. Выделенные по результатам молекулярно-генетического анализа образцы дикорастущего подсолнечника, несущие локус Pl6, представляют непосредственный интерес для селекции этой с/х культуры.
A search for new donor genes for resistance Downy mildew (Plasmopara halstedii) among annual and perennial wild species of Helianthus L was conducted. It is shown that the identification of the resistance locus Pl 6 in annual species is informative marker На Р2 (1200 bp), while in perennial species – На Р3 (1800 bp). At the same time it should be noted that for perennial species in most cases amplification of DNA with a primer На Р2 coincide with the results of PCR analysis with primer На Р2. Discovered on the results of molecular genetic analysis a wild forms, containing the locus Pl 6, are of direct interest for the breeding of cultivated sunflower.
sunflower (Helianthus)
Downy mildew
breeding
DNA markers

Введение

Наиболее рентабельным и экологически безопасным методом борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур является создание устойчивого исходного материала. Такой селекционный материал с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды целесообразно получать с привлечением генетического потенциала дикорастущих форм [1; 2]. Эффективному поиску генов устойчивости в настоящее время способствует применение современных технологий молекулярных ДНК-маркеров. В частности, как показано нами ранее на культурном подсолнечнике, они могут успешно использоваться в селекции линий резистентных к ложной мучнистой росе (ЛМР) Plasmopara halstedii [3]. Показавшие высокую информативность в данном случае STS-маркеры - НаР2 и НаР3 идентифицируют локус Pl6, который включает по меньшей мере 11 тесно сцепленных генов, каждый из которых контролирует устойчивость к одной из рас ЛМР [4; 5]. В связи с этим с помощью маркеров НаР2 и НаР3, идентифицирующих линии культурного подсолнечника, резистентные к ложной мучнистой росе, в данной работе был проведен поиск новых доноров генов устойчивости среди образцов однолетних и многолетних видов рода Helianthus L.

Материал и методы

В работе исследовали 22 образца 5-ти однолетних видов (табл. 1) и 91 образец 33-х многолетних видов (табл. 2) подсолнечника из Мировой коллекции ВИР. В анализе использовали праймеры HaP2 и НаР3 [4]. Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартной реакционной смеси в термоциклере PalmCycler Corbett Research (Австралия). Для проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 95 °С в течение 3 мин., затем 35 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 °С в течение 30 сек., элонгация - 2 мин. при 72 °С, денатурация при 95 °С - 30 сек., финальная элонгация - 1 мин. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием (1мкг/мл), используя трис-боратный буфер. После электрофореза гели переносили на трансиллюминатор и фотодокументировали с помощью видеосистемы (GelDoc 2000, BioRad, США). В качестве маркеров массы амплифицированных фрагментов использовали набор GeneRuler 1 Kb DNALadder (Fermentas).

Результаты и их обсуждение

В таблице 1 суммированы результаты анализа наличие/отсутствие маркеров локуса Pl6 в генотипе исследованных образцов однолетних видов подсолнечника.

Таблица 1

Образцы однолетних видов подсолнечника из Мировой коллекции ВИР

№, п/п

Вид

№ интродукции образца

Наличие гена Pl6 (HaP2/HaP3)

1

Helianthus annuus

441183

-/-

2

Helianthus annuus

441236

-/-

3

Helianthus annuus

441245

-/-

4

Helianthus annuus

545520

-/-

5

Helianthus annuus

441169

-/-

6

Helianthus annuus

545497

-/-

7

Helianthus annuus

504835

+/-

8

Helianthus annuus

436863

-/-

9

Helianthus annuus

440545

-/-

10

Helianthus annuus

545573

-/-

11

Helianthus annuus

545577

-/-

12

Helianthus annuus

545534

-/-

13

Helianthus agrophyllus

Без № ⃰ (4)

+/-

14

Helianthus agrophyllus

ARG-Mosambic

+/-

15

Helianthus agrophyllus

1000

-/-

16

Helianthus agrophyllus

Мозамбик 1000

-/-

17

Helianthus debilis

560388

-/-

18

Helianthus debilis

560395

-/-

19

Helianthus debilis

545666

-/-

20

Helianthus petiolaris

503232

-/-

21

Helianthus petiolaris

440660

-/-

22

Helianthus praecox

560400

-/-

Примечание: ⃰ - номер делянки

По результатам молекулярно-генетического анализа маркер НаР2, ассоциированный с признаком устойчивости к ЛМР, идентифицирован у образцов Helianthus annuus c номером интродукции 504835 и Helianthus argophillus (Б/№ и ARG-Mosambic) (табл. 1). Данные образцы характеризуются наличием на электрофореграмме ампликона 1200 п.н., специфичного локусу Pl6. С другой стороны, результаты амплификации маркера НаР3 не выявили локусов резистентности в генотипе исследованных однолетних видов. Следовательно, можно заключить, что праймер HaP3 оказался в данном случае не информативным для определения генов устойчивости в представленных генотипах однолетних дикорастущих форм.

В таблице 2 приведены данные ДНК-анализа многолетних видов подсолнечника. Результаты амплификации с праймером НаР2 показали, что маркер локуса устойчивости Pl6 присутствует у 14 из 91 исследованного образца. При этом популяции одного и того же вида с различными номерами интродукции демонстрируют полиморфизм по наличию/отсутствию искомого маркерного фрагмента (табл. 2).

Таблица 2

Образцы многолетних дикорастущих видов подсолнечника из Мировой коллекции ВИР

№, п/п

Вид

№ интродукции образца

Наличие локуса Pl6 (HaP2/HaP3)

1

Helianthus angustifolius

1889

+/+

2

Helianthus angustifolius

Б/№ ⃰ (5)

-/-

3

Helianthus angustifolius

Б/№ ⃰ (3)

-/-

4

Helianthusc californicus

530447

-/-

5

Helianthusc californicus

441063

-/+

6

Helianthusc californicus

Без № ⃰ (52)

-/-

7

Helianthus ciliaris

Без № ⃰ (51)

-/-

8

Helianthus decapetalus

440449

-/-

9

Helianthus decapetalus

545682

-/-

10

Helianthus decapetalus

Без № ⃰ (10)

-/-

11

Helianthus decapetalus

Б/№ ⃰ (11)

-/-

12

Helianthus decapetalus

Б/№ ⃰ (13)

-/-

13

Helianthus decapetalus

Б/№ ⃰ (14)

-/-

14

Helianthus decapetalus parviflorus

Б/№ ⃰ (15)

-/-

15

Helianthus divaricatus

2099

-/+

16

Helianthus divaricatus

545674

+/+

17

Helianthus divaricatus

Б/№ ⃰ (17)

-/-

18

Helianthus eggertii

Б/№ ⃰ (18)

+/-

19

Helianthus eggertii

Б/№ ⃰ (19)

-/-

20

Helianthus floridanus

94

-/-

21

Helianthus floridanus

Б/№ ⃰ (21)

-/-

22

Helianthus floridanus

Б/№ ⃰ (6)

-/-

23

Helianthus giganteus

441029

-/-

24

Helianthus giganteus

2100

+/+

25

Helianthus giganteus

Б/№ ⃰ (55)

-/-

26

Helianthus giganteus

Б/№ ⃰ (56)

-/-

27

Helianthus giganteus

489253 ⃰ (53)

-/+

28

Helianthus giganteus

489253 ⃰ (54)

-/-

29

Helianthus glaucophyllus

Б/№ ⃰ (95)

-/-

29

Helianthus grosseserratus

Б/№ ⃰ (64)

-/-

30

Helianthus grosseserratus

545698

-/-

31

Helianthus grosseserratus

Б/№ ⃰ (62)

+/+

32

Helianthus grosseserratus

Б/№ ⃰ (61)

-/-

33

Helianthus grosseserratus

545711

-/-

34

Helianthus hirsutus

560389

-/-

35

Helianthus hirsutus

441331

+/+

36

Helianthus hirsutus

Б/№ (20)

-/-

37

Helianthus kellemanii

Б/№ ⃰ (93)

-/-

38

Helianthus laetiflorus

1886

-/-

39

Helianthus laetiflorus

Б/№ ⃰ (41)

+/+

40

Helianthus laetiflorus

Б/№ ⃰ (39)

-/-

41

Helianthus laevigatus

Б/№

-/-

42

Helianthus macrophyllus (болгарский)

Б/№ ⃰ (91)

-/-

43

Helianthus macrophyllus (российский)

Б/№ ⃰ (92)

-/-

44

Helianthu smaximiliani

2099

-/-

45

Helianthus maximiliani

440553

+/+

46

Helianthus maximiliani

Б/№ ⃰ (67)

-/-

47

Helianthus maximiliani(настоящий)

Б/№ ⃰ (65)

-/-

48

Helianthus maximiliani(поздний)

96А

-/-

49

Helianthus microcephalus

Б/№ ⃰ (68)

-/-

50

Helianthus mollis

50/88

-/-

51

Helianthus mollis

2102

-/-

52

Helianthus mollis (фертильный)

530453

-/-

53

Helianthus mollis (стерильный)

Б/№ ⃰ (69)

-/-

54

Helianthus nuttallii

442735

-/-

55

Helianthus nuttallii

Б/№ ⃰ (70)

-/-

56

Helianthus nuttallii

Б/№ ⃰ (71)

-/-

57

Helianthus nuttallii

Б/№ ⃰ (72)

-/-

58

Helianthus occidentalis

441062

+/+

59

Helianthus occidentalis

Б/№ ⃰ (1)

-/-

60

Helianthus occidentalis

Б/№ ⃰ (2)

-/-

61

Helianthus occidental sspp. occidentalis

Б/№ ⃰ (7)

-/-

62

Helianthus occidentalis

611801

+/-

63

Helianthus orgyalis

Б/№ ⃰ (86)

-/-

64

Helianthus parichi

Б/№ ⃰ (82)

-/-

65

Helianthus parichi

Б/№ ⃰ (83)

-/-

66

Helianthus rigidus

545660

+/+

67

Helianthus rigidus

545681

-/-

68

Helianthus rigidus

545646

-/+

69

Helianthus rigidus

1886

-/+

70

Helianthus rigidus

2106

-/+

71

Helianthus rigidus

545658

-/-

72

Helianthus rigidus

Б/№ ⃰ (37)

-/-

73

Helianthus rigidus

Б/№ ⃰ (38)

-/-

74

Helianthus salicifolius (болгарский)

Б/№ ⃰ (36)

-/-

75

Helianthus salicifolius

440074

-/+

76

Helianthus scaberimus

Б/№ ⃰ (88)

-/-

77

Helianthus simulans

545659

+/+

78

Helianthus simulans

Б/№ ⃰ (8)

-/-

79

Helianthus smithii

Б/№ ⃰ (9)

-/+

80

Helianthus strumosus

440679

+/+

81

Helianthus strumosus

440683

+/+

82

Helianthus sub canescens (болгарский)

Б/№ ⃰ (90)

-/-

83

Helianthus sub connencens

Б/№ ⃰ (89)

-/-

84

Helianthus tomentosus

2107

-/-

85

Helianthus trachelifolius

Б/№ ⃰ (81)

-/-

86

Helianthus tuberosus

441026

-/-

87

Helianthus tuberosus

Б/№ ⃰ (48)

-/-

88

Helianthus tuberosus

2111

-/-

89

Helianthus tuberosus vilmorin

Б/№ ⃰ (47)

-/-

90

Helianthus tuberosus subcon

Б/№ ⃰ (46)

-/-

91

Helianthus umbaburensis

Б/№ ⃰ (84)

+/+

Примечание: ⃰ - номер делянки

Результаты амплификации маркера НаР3 подтвердили наличие локусов резистентности к ЛМР у образцов H. angustifolius (1889), H. divaricatus (545674), H. giganteus (2100), H. grosseserratus (Б/№ ⃰ (62)), H. hirsutus (441331), H. laetiflorus (Б/№ ⃰ (41)), H. maximiliani (440553), H. occidentalis (441062), H. rigidus (545660), H. simulans (545659), H. strumosus (440679), H. strumosus (440683) и H. umbaburensis (Б/№ ⃰ (84)). В данном случае НаР3 инициировал синтез фрагмента размером около 1800 п.н., характерного для устойчивых линий. Также было показано наличие маркера НаР3 в продуктах амплификации растений H. californicus (№ 441063), H. divaricatus (№ 2099), H. giganteus (№ 489253), H. rigidus (№ 545646, 1886, 2106), H. salicifolius (№ 440074), Helianthus smithii (Б/№ ⃰ (9)) в то время как маркер НаР2 показал отсутствие локусов резистентности к ЛМР у данных форм. У образцов видов H. ciliaris, H. decapetalus, H. floridanus, H. glaucophyllus, H. kellemanii, H. laevigatus, H. macrophyllus, H. smaximiliani, H. mollis, H.microcephalus, H. nuttallii, H. orgyalis, H. parichi, H. scaberimus, H. sub connencens, H. tomentosus, H.trachelifolius, H. tuberosus маркерные фрагменты HaP2/HaP3 локуса Pl6 не обнаружены.

Таким образом можно заключить, что для идентификации локуса устойчивости Pl6 у однолетних видов подсолнечника наиболее информативным является маркер НаР2, а у многолетних видов - НаР3. В то же время необходимо отметить, что в большинстве случаев у многолетних видов результаты амплификации ДНК с праймером НаР2 совпадают с результатами ПЦР-анализа с праймером НаР3. По результатам молекулярно-генетического анализа с данными праймерами были выделены новые доноры генов устойчивости среди однолетних и многолетних видов рода Helianthus L. Выделенные образцы из коллекции ВИР представляют непосредственный интерес для селекции культурного подсолнечника.

Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).

Рецензенты:

Чистяков В.А., д.б.н., заведующий лабораторией экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, г. Ростов-на-Дону.

Костылев П.И., д.с.-х.н., профессор, заведующий лабораторией риса ГНУ «ВНИИЗК им. И.Г. Калиненко» РАСХН, г. Зерноград.