Введение

В норме биогенез и функционирование хлоропластов находятся под генетическим контролем ядра и клеточных органелл, их гармоничным взаимодействием. Однако механизмы такого взаимодействия до сих пор изучены не достаточно глубоко (Даниленко, Давыденко, 2003). Многолетние исследования, проводимые в нашей лаборатории, всегда были направлены на решение большой и сложной проблемы пластидно-ядерных взаимоотношений (Белецкий, 1989; Зиноватная и др., 1995; Усатов и др., 2010).

Одним из перспективных подходов в этой области является создание и исследование генетических моделей, совмещающих в себе мутантные пластиды и ядерные хлорофильные мутации. Коллекция хлорофильных мутантов различной генетической природы, имеющаяся в нашем распоряжении (Усатов и др., 2004а), является удобным исходным материалом для создания таких совмещённых форм. Широкий спектр хлорофильных мутаций, представленных в коллекции, позволяет наиболее полно охватить функциональные взаимосвязи между клеточными компартментами растительной клетки (Усатов и др., 2004б; Рассадина и др., 2005). Уникальность коллекции заключается в том, что все хлорофильные мутанты получены с помощью N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ) на генетической основе одной инбредной линии (Усатов и др., 1995; Усатов и др., 2005).

Целью работы является совмещение и анализ в одном растительном организме мутантного пластома с хлорофильными мутациями ядерной природы подсолнечника.

Материал и методы

Объектом исследований служили растения исходной линии 3629 подсолнечника Helianthus annuus L., также хлорофилльные ядерные монорецессивные (n:chlorina-3, n:chlorina-5) и пластомные мутанты (en:chlorina-6, en:chlorina-7), полученные на её генетической основе. Совмещение мутантных пластид с мутантными ядерными генами проводили с предварительной кастрацией цветков и искусственным опылением с последующей изоляцией соцветий по следующей схеме:

Родители - pHH x Phh

F₁ - pHh

F₂ - 1pHH : 2pHh : 1phh, где

Р - нормальный пластом, р - мутантный пластом, H и h - ядерные хлорофилльные гены дикого и мутантного типов, соответственно.

Поскольку передача пластома у подсолнечника происходит строго по материнской линии, внеядерные хлорофилльные мутанты en:chlorina-6 и en:chlorina-7 использовали в гибридизации в качестве материнских растений. Изучали F₁-F₂ поколения. Для статистической оценки результатов расщепления применяли метод χ². У линий и гибридов F₁, F₂ в фазу бутонизации в листьях определяли содержание хлорофиллов (Гавриленко и др., 1975), а в фазу полного созревания высоту растений и диаметр корзинок. В промерах использовали не менее 20 растений каждой формы. Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента (Бейли, 1973).

Результаты и их обсуждение

В F₁ были получены 4 гибридные формы. Две из них - с мутантным пластомом en:chlorina-6 и рецессивными хлорофильными мутациями n:chlorina-3 и n:chlorina-5 в гетерозиготном состоянии и две - с пластомом en:chlorina-7 с соответствующими ядерными генами. Все растения 1-го гибридного поколения этих скрещиваний имели мутантную жёлто-зелёную окраску листьев, не отличаясь по содержанию хлорофиллов и показателям габитуса от материнских форм en:chlorina.

Результаты изучения F₂ представлены в таблице 1. Во 2-м гибридном поколении, как и в 1-м, все растения имеют мутантный пластом. В дополнении к этому, у 1/4 растений мутантный ядерно-рецессивный хлорофильный ген находится в гомозиготном состоянии. Вследствие этого у гибридов в F₂ наблюдается расщепление на два типа растений: chlorina, то есть растения, фенотипически повторяющие материнскую форму, и растения промежуточного типа между жёлто-зелёной chlorina и xantha (летальный тип хлорофильной мутации с жёлтым цветом листьев). В нашем случае промежуточные формы были представлены жизнеспособными растениями с резко уменьшенным габитусом и количеством зелёных пигментов по сравнению с мутантными родителями (табл. 2). В двух гибридных скрещиваниях en:chlorina-7 x n:chlorina-3 и en:chlorina-7 x n:chlorina-5 наблюдается классическое менделевское расщепление, т.е. 1/4 таких растений с усилением дефекта окраски, что соответствует количеству растений, несущих хлорофилл-мутантный ядерный ген в гомозиготном состоянии. У гибридов en:chlorina-6 x n:chlorina-3 и en:chlorina-6 x n:chlorina-5 числовые отношения при расщеплении значительно отклоняются от теоретически ожидаемого 3:1 (табл. 1).

Таблица 1

Расщепление в потомстве гибридов F₁

Возможно, совмещение мутантного хлорофильного ядерного гена и мутантных пластид, усугубляя хлорофильный дефект и понижая жизнеспособность гибридных растений, обуславливает нехватку гомозигот по ядерному хлорофильному гену.

В таблице 2 приведены результаты полевых измерений габитуса растений и содержания хлорофиллов контрольной зеленой линии 3629, исходных мутантов chlorina и гибридов F₂ типа xantha. Видно, что родительские мутанты chlorina отличаются от исходных зеленых растений линии 3629 по высоте (64,6 % - 82,8 %) и диаметру корзинки (60,4 % - 76,2 %). Причем самые низкие показатели габитуса представлены у мутанта n:chlorina-3, а самые высокие - у en:chlorina-7.

Таблица 2

Показатели габитуса растений и содержания хлорофиллов у зеленой линии 3629, мутантов chlorina и гибридов F₂ типа xantha

Хлорофильные ядерные гены, находясь в гомозиготном состоянии, в комбинации с мутантными пластогенами, существенно влияют на габитус гибридов F₂, снижая в различной степени показатели роста и диаметра корзинки, как по сравнению с материнскими внеядерными мутантами (en:chlorina-6 и en:chlorina-7), так и отцовскими - ядерными (n:chlorina-3 и n:chlorina-5), соответственно. При этом самые низкорослые формы получены в результате скрещивания en:chlorina-6 x n:chlorina-3 (47,6 % высота растений и 51,5 % диаметр корзинки от соответствующих показателей растений 3629), а самые мощные - в результате скрещивания en:chlorina-7 x n:chlorina-5 (62,7 % высота растений и 59,4 % диаметр корзинки от соответствующих показателей растений 3629).

Из таблицы 2 следует, что содержание хлорофиллов в пластомных мутантах en-chlorina-6 и en-chlorina-7 составляет только 82,6 % и 76,9 % от контроля, соответственно. В листьях ядерных хлорофильных мутантов n:chlorina-3 и n:chlorina-5 содержание зелёных пигментов ещё меньше - 68,0 % и 61,2 % от их содержания в норме. У гибридов F₂ типа xantha содержание пигментов примерно вдвое ниже, чем у соответствующей родительской формы с наименьшим содержанием хлорофиллов.

Таким образом, во всех изученных комбинациях скрещиваний, при совмещении мутантных ядерных и пластидных генов, у гибридов с фенотипом xantha происходит резкое снижение показателей габитуса и содержания хлорофиллов, относительно не только зелёных растений 3629, но и жёлто-зелёных мутантов chlorina. Следовательно, объединение мутантных наследственных систем ядра и пластид вызывает значительное усиление хлорофильных дефектов. Полученные формы являются хорошей моделью для исследования тонких механизмов взаимодействия ядерного генома и пластома в биогенезе и функционирования хлоропластов.

Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).

Рецензенты:

Чистяков В. А., доктор биологических наук, заведующий лабораторией экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, 344090 г. Ростов-на-Дону.

Михайлов Н. В., доктор сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики и биотехнологии НИИ биоинформатики, биотехнологии и живых систем ДонГАУ, 346493, Ростовская область, Октябрьский район, поселок Персиановский.