Микроорганизмы представляют собой большой потенциал для поиска продуцентов антивирусных агентов. Литературные данные свидетельствуют о способности микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, ингибировать развитие вирусов. Наличие у бактерий и грибов разнообразных механизмов воздействия на вирусы дает возможность разрабатывать препараты на комплексной основе, влияющие на различные этапы репродукции вирусов [10]. Вирус гриппа является самым известным и распространенным среди вирусов, обусловливающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. В настоящее время циркулируют два основных субтипа вируса гриппа типа А: H1N1 и H3N2 и тип В, вызывающие ежегодные эпидемии гриппа. Вирус гриппа часто мутирует, в результате чего имеющиеся препараты становятся не эффективными. Это связано с возникновением мутаций, приводящих к появлению резистентности вируса гриппа к противовирусным препаратам, таким как ремантадин, озельтамивир и ряду других. [3, 10]. В сложившейся ситуации вопрос о необходимости разработки и поиска новых средств защиты от гриппозной инфекции, включающих как профилактические, так и лечебные препараты, представляется крайне важным и особо актуальным. В этом плане представляет интерес изучение ферментов нуклеинового обмена грибов и бактерий, отдельные виды которых секретируют значительное количество нуклеаз - ферментов, деполимеризующих нуклеиновые кислоты. Они находят широкое применение в практическом использовании в качестве лечебных и профилактических препаратов, в противовирусной терапии и при лечении онкологических заболеваний [1, 2, 4, 5].

Основным источником этих ферментов являются почвенные бактерии, грибы и дрожжи. Скрининг микроорганизмов, продуцентов секретируемых нуклеаз, позволил установить, что наиболее активными продуцентами РНКаз среди бактерий являются представители рода Bacillus, нуклеазы, обладающие РНКазной и ДНКазной активностями, продуцируют бактерии родов Staphylococcus и Serratia [1]. Результаты испытаний противовирусных свойств нуклеаз, проведенных рядом авторов, показали, что эти ферменты могут стать одним из достаточно эффективных средств профилактики и лечения различных вирусных заболеваний человека и животных. Показано, что рибонуклеазы обладают выраженной противовирусной активностью в отношении таких РНК-содержащих вирусов, как вирус гриппа, полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства [2, 4-6]. Обнаружение РНКаз и ДНКаз с новыми свойствами позволит создать препараты, расширяющие диапазон действия имеющихся в настоящее время противовирусных средств.

Целью данной работы является изучение свойств и оценка противовирусной активности водных экстрактов нового штамма бактерии Aeromonas bestiarum Bp-1010.

Материалы и методы

В качестве продуцента противовирусных соединений использовали бактериальный штамм Aeromonas bestiarum Bp-1010, выделенный нами ранее из донных осадков озера Байкал, депонированный в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"» под № В-1270. При его культивировании применяли следующие питательные среды: рыбный питательный агар (РПА, Оболенск, Россия), среду S, содержащую (г/л): пептон («Difco», США) - 16,0; NaCI - 5,0; МgCl₂ - 0,1; Трис - 6,05; pH 8,0; жидкую (LВ) и агаризованную (LA) среды pH 7, 2 («Difco», США),

В качестве вирусных агентов использовали РНК-содержащий вирус: гриппа человека А/Aichi/2/68 (H3N2) и гриппа птиц A/chiken/Kurgan/05/2005 (H5N1); ДНК-содержащие вирусы: ортопоксвирусы - вирус осповакцины (ВОВ, штамм Л-ИВП) и вирус оспы мышей (ВОМ, штамм К-1), а также вирус простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2, штамм MS), полученные из Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Для определения наличия нуклеаз (Н) биомассу отдельных колоний суспендировали в 150-200 мкл дистиллированной воды или TEN буфера (0,1 М Трис - рН 7,5; 0,01 М ЕДТА; 0,05 М NaCl). Бактериальные клетки лизировали лизоцимом (0,5 мг/мл) с добавлением тритона Х-100 (0,1 %) или ультразвуком на дезинтеграторе MSE (Англия). Аликвоты клеточного экстракта (КЭ) в количестве 1-2 мкл вносили в реакционную смесь (W), содержащую 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI pH 8,5; 10 mM MgCI₂;1 mM DTT и 1 мкг субстратной ДНК фагов l или Т7 или РНК фага MS2. Все субстраты производства фирмы СибЭнзим (Новосибирск). Продукты реакции подвергали электрофорезу в 0.8 %-ном агарозном геле («Sigma», США)._. О наличии нуклеаз в штаммах микроорганизмов и их активности судили по исчезновению полосы субстратной ДНК на картине электрофореграммы в УФ-свете, а также по отсутствию следов РНК в геле [8, 9] .

Количественную оценку нуклеазной активности проводили по превращению субстратных нуклеиновых кислот во фрагменты, растворимые в 4-х %-ной HClO₄, с появлением кислоторастворимого материала с абсорбцией при D₂₆₀ нм. [7]. За единицу нуклеазной активности (Е) принимали количество фермента, вызывающего увеличение адсорбции на 1,0 оптическую единицу при D₂₆₀ нм за 20 мин при 37 °С.

Удельную активность измеряли в Е/мг белка. Концентрацию белка в образцах определяли по формуле: С мг/мл=(D_228,5-D_234,5):3 х n, где D-оптическая плотность, n-разведение образца.

Для приготовления образцов препаратов использовали бактериальные клетки, наработанные в среде LB или среде S с использованием термостатированной качалки (КТ-104, Россия, 180 об./мин, 30 °C). Для получения клеточных экстрактов (КЭ) влажную биомассу в количестве 1 г подвергали разрушению в 4-х мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5 °C, контролируя на спектрофотометре падение величины D₅₆₀ до уменьшения оптической плотности суспензии на 80-90 % от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (10 тыс. об./мин, 20 мин, при температуре 4-5 °C). Далее полученные образцы исследовали на противовирусную активность in vitro.

Для тестирования цитотоксичности и противовирусной активности образцов относительно вируса гриппа использовали перевиваемую культуру клеток MDCK. Клеточную суспензию доводили до посевной концентрации 1,0-1,5×10⁵ кл./мл средой RPMI-1640 (ООО «Биолот», С-Петербург), содержащей 10 % сыворотки крови плодов коровы («Gibco», США) и вносили по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Планшеты с клетками помещали в термостат на 2-3 суток при температуре 37 ºC, 5 % СО₂ и 100 % влажности до образования монослоя. Для тестирования токсичности и противовирусной эффективности бактериальных метаболитов относительно вирусов ВОВ, ВОМ и ВПГ-2 в аналогичных условиях инкубировали перевиваемую культуру клеток Vero. Культуры клеток MDCK и Vero были получены из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Для определения токсических доз метаболитов образцы разводили в 2, 5, 10, 20 раз средой RPMI-1640 или DMEM (ООО «Биолот», С-Петербург) и вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK или Vero, соответственно и в течение 2-х суток инкубировали в термостате при температуре 37 °C, 5 % СО₂ и 100 % влажности. Затем с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток, инкубированных с разными концентрациями образцов. Для определения противовирусной активности использовали максимально переносимые концентрации образцов для клеток MDCK и Vero. Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK («Sigma», США), или среды DMEM. Исследование противовирусной активности образцов проводили по профилактической схеме: сначала на культуру клеток вносится образец и затем вирус.

Для определения противовирусной активности образцов в монослой культур клеток вносили по 50 мкл/лунку выбранного разведения образца, через 1 ч инкубации при температуре 37 ºC, 5 % СО₂ и 100 % влажности вносили по 50 мкл/лунку разведений вирусалантоисной жидкости (ВАЖ) от 1 до 8. Клетки инкубировали в течение 2-х суток для вируса гриппа и 3-х суток для ДНК-содержащих вирусов при температуре 37 ºC в атмосфере 5 % СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Затем в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие (ЦПД) в монослое клеток и определяли титр вируса. Дополнительно наличие вируса гриппа в среде культивирования тестировали по реакции гемагглютинации (РГА) с 1 % эритроцитами петуха. Определяли титры инфекционных вирусов в клетках в lg ТЦД₅₀/мл в опыте и контроле (ИД₅₀ in vitro с образцом и без него), а затем высчитывали индексы нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием образцов.

Результаты и обсуждение

Методом скрининга на селективных средах с добавлением ДНК и РНК отобраны бактериальные изоляты, обладающие нуклеазной активностью, которые затем были проанализированы на наличие нуклеаз методом электрофореза в агарозе. В результате анализа выяснено, что изолят Вр-1010 обладает наиболее высокой РНКазной активностью, по сравнению с другими изолятами. Средняя удельная РНКазной активность бактериального штамма составила 110,0 Е/мг белка. В соответствии с выявленными фенотипическими признаками и по результатам молекулярно генетического анализа (сходство по фрагментам последовательностей 16S рРНК с имеющимися в GenBank на уровне 99 %) эта бактерия была отнесена к виду Aeromonas bestiarum.

В процессе работы было показано, что основная нуклеазная активность (РНКазная и ДНКазная) штамма бактерии A. bestiarum Bp-1010 содержится в клеточной биомассе и в меньшей степени в культуральной жидкости (КЖ). В дальнейшем для исследования его противовирусной активности использовали клеточные экстракты (КЭ), полученные после разрушения биомассы ультразвуком. Оптимальные условия работы ферментов, гидролизующих РНК, определяли при 3-х значениях рН: 6,0, 7,0 и 8,5. Максимальный уровень активности метаболитов КЭ наблюдали в буфере W при рН 8,5. При анализе отдельных колоний штамма A. bestiarum Bp-1010 был выделен клон, с активностью РНКазы в культуральной жидкости (КЖ) - 178,2 ед./мл, а в клеточном экстракте 732,6 ед./мл, (использована среда S, культивирование в течение 24 ч, при температуре 30 °C).

Определение противовирусной активности водорастворимых метаболитов КЭ штамма A. bestiarum Вр-1010 по отношению к вирусу гриппа показало, что КЭ данного штамма при профилактической схеме введения вызывает в культуре клеток MDCK выраженное ингибирование репродукции вируса гриппа субтипа A/H3N2 и практически полное ингибирование репродукции вируса гриппа субтипа A/H5N1 (табл. 1).

Таблица 1

Противовирусная активность клеточного экстракта штамма A. bestiarum Вр-1010 в культуре клеток MDCK относительно вируса гриппа разных субтипов

Вирус гриппа	№№ экстракта	Титр вируса гриппа (lg ТЦД50/мл):		Индекс нейтрализации вируса (ИН), lg под действием экстракта клеток
		в присутствии экстракта	без экстракта (контроль)
A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)	1	0	2,5±0,10	2,5
	2	0,5±0,07	6,5±0,10	6,0
A/Aichi/2/68 (H3N2)	1	0,1	2,5±0,05	2,4
	2	1,5±0,13	6,5±0,20	5,0

Примечание: эксперименты проведены в трех повторностях.

Полученные данные свидетельствуют о способности метаболитов штамма A. bestiarum Вр-1010 к ингибированию репродукции вируса гриппа субтипов А/H3N2 и A/H5N1 на культуре клеток MDСK в профилактической схеме анализа.

Определение противовирусных свойств образцов КЭ в отношении ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа проводили на клетках Vero (табл. 2). Для проведения испытаний использовали образцы КЭ с РНКазной активностью не менее 492,8 Е/мл и ДНКазной активностью не менее 50,6 Е/мл. Исследованные образцы имели низкую токсичность для клеток Vero. Средние данные по трем повторностям опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2

Противовирусная активность клеточного экстракта штамма A. bestiarum Вр-1010 в культуре клеток Vero в отношении ДНК-содержащих вирусов

Вирус	Титр вируса (lg ТЦД50/мл):		Индекс нейтрализации вируса (ИН), lg под действием экстракта клеток
	в присутствии экстракта	без экстракта (контроль)
ВОМ	1,7±0,13	4,6±0,10	2,9
ВПГ-2	3,3±0,16	5,3±0,08	2,0
ВО	3,3±0,11	4,5±0,12	1,2

Образцы КЭ штамма A. bestiarum Вр-1010 проявили незначительное противовирусное действие в отношении ВО (ИН -1,2 lg), но были активны в отношении вирусов ВПГ-2 и ВОМ (табл. 2). Индексы нейтрализации репродукции вируса простого герпеса 2-го типа и вируса оспы мышей в культуре клеток Vero под действием исследуемого КЭ составили 2,0 и 2,9 lg соответственно.

Заключение. В процессе анализа ряда микроорганизмов на наличие нуклеаз был выявлен штамм бактерии Aeromonas bestiarum Вр-1010 со средней удельной РНКазной активностью 110,0 Е/мг белка. Показана противовирусная активность данного штамма в профилактической схеме в отношении РНК-содержащего вируса гриппа разных подтипов: А/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), а также ДНК-содержащих: вируса оспы мышей и вируса простого герпеса 2-го типа. Важно отметить, что при наличии эффективного противовирусного действия исследованный бактериальный штамм обладает незначительной токсичностью относительно клеток MDCK и Vero.

Полученные результаты позволяют считать штамм A. bestiarum Вр-1010 перспективным в целях разработки препаратов широкого спектра действия для профилактики и лечения вирусных заболеваний.

Наличие в исследуемых бактериальных препаратах активности против РНК- и ДНК- содержащих вирусов позволяет предположить наличие среди продуцируемых метаболитов не только РНКаз, но и ДНКаз либо неспецифичной к углеводному остатку нуклеазы, способной к гидролизу как РНК, так и ДНК.

Рецензенты:

Теплякова Т. В., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией микологии отдела биофизики и экологических исследований Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Роспотребнадзора РФ), пос. Кольцово;

Лебедев Л. Р., д.м.н., заведующий лабораторией нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков Института медицинской биотехнологии Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Роспотребнадзора РФ), г. Бердск.