Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

ESTIMATE OF POPULATION'S GENE POOL OF WESTERN RACE OF SIBERIAN LARCH LARIX SIBIRICA LEDEB. (L. SUKACZEWII) IN THE MIDDLE AND NORTHREN URALS

Nechaeva Yu.S. 1 Zhulanov A.A. 1 Krasilnikov V.P. 1 Boronnikova S.V. 1
1 Perm State University
Дана характеристика генофондов девяти популяций западной расы лиственницы сибирской L. sibirica Среднего и Северного Урала на основании анализа полиморфизма двух типов молекулярных маркеров (ISSR и SNP). Обнаружено, что в совокупности изученные популяции характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия: доля полиморфных локусов (Р95) составила 0,951, ожидаемая гетерозиготность (HE) в суммарной выборке – 0,202, а гаплотипическое разнообразие (Hd), определенное на основании полиморфизма SNP-маркеров – 0,896. Наибольшими значениями показателей генетического разнообразия характеризовались популяции Ls5 и Ls9, а наименьшими – Ls7. При оценке уникальности генофонда использовали коэффициент генетической оригинальности (КГО), анализ которого позволил выявить популяции с типичными и специфичными для региона генофондами. Для комплексной оценки состояния генофондов популяций все установленные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную на примере изученных природных популяций L. sibirica шкалу оценки состояния генофондов. Установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды восьми изученных популяций, а в одной популяции (Ls7) отмечены признаки обеднения генофонда. Даны рекомендации по отбору популяций в качестве объектов сохранения генофондов L. sibirica на Среднем и Северном Урале.
The characteristic of the gene pools of nine populations of the western race of Siberian larch L. sibirica Middle and Northern Urals, based on the analysis of polymorphism of two types of molecular markers (ISSR and SNP). It was found that the total populations is characterized by a high level of genetic diversity: the percent of polymorphic loci (Р95) was 0.951, the expected heterozygosity (HE) in the total sample – 0.202, and the haplotype diversity (Hd), calculated on the basis of polymorphism SNP-markers – 0.896. The highest values of indicators of genetic diversity of a have population Ls5 and Ls9, and the least – Ls7. In estimating the uniqueness of gene pool, we used the factor of genetic originality (FGO), the analysis of which revealed a population with typical and specific gene pools for the study region. For a complex estimate of the status of populations gene pools all set of genetic diversity indicators were arranged in scale estimate of the state of gene pools on the example of studying natural populations of L. sibirica. It was found that in a acceptable status from all the studied populations gene pools, the one population (Ls7) has signs of depletion of the gene pool. We provides recommendations for the selection of populations as objects of the gene pools conservation L. sibirica in the Middle and Northern Urals.
DNA polymorphism
genetic diversity
ISSR-markers
snp- markers
gene pools of populations
larix sibirica ledeb.

Оценка современного состояния биологического разнообразия лесных фитоценозов и их ресурсов играет важную роль в формировании как фундаментальных основ изучения и сохранения растительных ресурсов, так и прикладных аспектов их рационального использования в хозяйственно-экономических интересах страны. На основе оценки характера изменчивости и популяционной структуры можно наметить общие пути сохранения генофонда вида в регионе на популяционной основе, отобрать локальные популяций для сохранения и воспроизводства вида. Однако популяционный подход остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений [7]. Изучение генофондов ресурсных видов растений с использованием молекулярных маркеров ДНК основано на анализе количественных характеристик генетического разнообразия популяций [3]. Для характеристики генетического разнообразия гетерогенных природных популяций растений необходим молекулярно-генетический анализ их генофондов с использованием, как минимум, двух типов высоко полиморфных молекулярных маркеров [2]. Эти маркеры должны давать возможность анализа полиморфизма различных структурных элементов генома. Так, ISSR-маркеры выявляют полиморфизм участков ДНК, заключенных между тандемно повторяющимися элементами – микросателлитами [10], и приобрели большую популярность для изучения генетического разнообразия ресурсных травянистых [1] и древесных видов растений [8]. Другой тип молекулярных маркеров (SNP-маркеры) выявляют нуклеотидный полиморфизм в локусах структурных генов. В совокупности два типа молекулярных маркеров позволяют проанализировать большую часть генома изучаемого вида, дать разностороннюю характеристику изучаемых генофондов и выявить их специфические особенности. Большую актуальность приобретает изучение генофондов ресурсных видов растений, занимающих обширные ареалы и имеющих хозяйственное значение, таких как виды рода Larix Mill., которые являются самыми распространенными древесными видами растений России и играют большую водоохранную и почвозащитную роль, особенно в северных и горных лесах. На Урале род Larix представлен западной расой лиственницы сибирской или л. Сукачева (Larix sukaczewii Dyl.). В связи с этим изучение генофондов популяций L. sibirica Северного и Среднего Урала на основе анализа полиморфизма двух типов ДНК-маркеров и разработка методики оценки состояния генофондов этого вида являются актуальной задачей для сохранения популяций лесных древесных видов, продуктивных и устойчивых к действию различных факторов среды.

Таким образом, цель данного исследования – дать характеристику и оценку состояния генофондов популяций западной расы лиственницы сибирской Северного и Среднего Урала на основании анализа полиморфизма двух типов молекулярных маркеров.

Материал и методы исследования

В качестве объектов исследований избраны девять природных популяций западной расы лиственницы сибирской, произрастающих на Среднем и Северном Урале, восемь из которых располагаются в Пермском крае: в государственном заповеднике «Вишерский» (Ls1, Ls2), около г. Красновишерск (Ls3); в Чердынском (Ls4), в Гаинском (Ls5), в Добрянском (Ls7), в Суксунском (Ls8) районах, а также две популяции находятся в Свердловской области: вблизи г. Качканар (Ls6) и пос. Билимбай (Ls9).

Для проведения молекулярно-генетического анализа в каждой из популяций собрана хвоя – индивидуально с 28–30 деревьев. Для выделения ДНК использовали методику С. Роджерса [9] с небольшими модификациями. Для полимеразной цепной реакции ISSR-методом реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы; 2,5 мкл 10х буфера + MgCl2 («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 0,25 мM dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл ДНК. Амплификацию ДНК проводили по стандартной для ISSR-метода программе с пятью ISSR-праймерами: М3 – (AC)8CT, Х10 – (AGC)6C, Х11 – (AGC)6G, ISSR-8 – (GAG)6C, CR-215 – (CA)6GT. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием. Фотографирование и определения длины фрагментов ДНК проводили с помощью системы гель-документации GelDoc и программы Quantity One («Bio-Rad», USA). Для выявления SNP-маркеров в геноме L. sibirica отобраны три локуса потенциально адаптивно-значимых генов: 4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS, амплификацию и секвенирование последовательностей данных локусов проводили в соответствии с рекомендациями, приведенными в литературных источниках [5].

Компьютерный анализ полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ POPGENE 1.31 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли (Р95) полиморфных локусов, абсолютного (na) числа аллелей, эффективного (ne) числа аллелей, ожидаемой (HE) гетерозиготности, информационного (I) Индекса Шеннона. Для выявления структуры внутрипопуляционного разнообразия применяли показатели внутрипопуляционного разнообразия (μ) и доли редких морф (h) [4]. Редактирование секвенированных последовательностей проводили в программе Sequence Scannerv1.0, местоположение полиморфных позиций определяли посредством выравнивания послeдоватeльностeй в компьютерной программе BioEdit v7.2.5. В программе DNASP v5 были реконструированы гаплотипы и на основе сравнения их нуклеотидных последовательностей рассчитаны общее гаплотипическое разнообразие (Hd) и нуклеотидное разнообразие (π), оценивающее среднее число парных различий на сайт. Оценка состояния генофондов популяций проведена в соответствии с методикой С. В. Боронниковой [2]. Выявлeниe спeцифичeских особeнностeй гeнофондов было провeдeно по модифицированной для дикорастущих дрeвeсных видов растeний мeтодикe подсчeта коэффициeнта гeнeтичeской оригинальности – КГО [6].

Результаты и их обсуждение

ISSR-маркеры в зависимости от праймера у L. sibirica выявляли от 17 до 34 ISSR-маркеров и всего в девяти популяциях было детектировано 123 ISSR-маркера, из которых 117 были полиморфными, то есть в совокупности изученные популяции характеризуются высокой долей полиморфных локусов (Р95=0,951). В отдельных популяциях этот показатель варьировал в пределах от 0,741 в популяции Ls7 до 0,871 в популяции Ls9 (табл. 1). Другой из основных показателей генетической изменчивости – ожидаемая гетерозиготность (HE). Она в суммарной выборке составила 0,202. Этот показатель выше в популяции Ls9 (HE=0,246), а самое низкое его значение (HE=0,171) отмечено в популяции Ls7. Для анализа генетического разнообразия на популяционном уровне был применен индекс разнообразия Шеннона. Он также выявил наибольшее разнообразие в популяции Ls9 (I=0,369), а наименьшее (I=0,258) – в популяции Ls7 (табл. 1). В дополнение к показателям, полученным на основании полиморфизма ISSR-маркеров, проведена характеристика генетического разнообразия изученных популяций на основе анализа гаплотипического разнообразия трех локусов потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica. Наибольшим гаплотипическим разнообразием характеризуется популяция Ls9 (Hd=0,911), а самое низкое значение этого показателя (Hd=0,636) выявлено в популяции Ls8. (табл. 1).

Большое значение для характеристики генофондов имеют показатели внутрипопуляционного разнообразия, анализ которого с применением показателя μ установил, что из 9 изученных популяций большей равномерностью распределения частот аллелей характеризуются популяции Ls5 и Ls9 (μ=1,747 и 1,738 соответственно), а наименьшей (μ=1,626) – популяция Ls7 (табл. 2). Показатель доля редких морф (h) оценивает структуру внутрипопуляционного разнообразия. По мнению Л. А. Животовского (1980), чем меньше значения h порогового 0.3, тем более сбалансированной структурой разнообразия характеризуются популяции. У всех изученных популяций показатель h имеет значения меньше 0,3 (табл. 1), наиболее сбалансированной структурой разнообразия характеризуется популяция Ls5 (h = 0,113), а наименее (h=0,187) популяция Ls7 (табл. 1). Для сравнения данных о внутрипопуляционном разнообразии, полученных с помощью двух типов ДНК-маркеров, проведен расчет показателя h на основании полиморфизма локуса 4CL1-363. В качестве морф рассматривалось число гаплотипов в популяции. В результате получены аналогичные ISSR-маркерам закономерности в распределении и структуре внутрипопуляционного разнообразия изученных популяций L. sibirica. Наиболее сбалансированной структурой нуклеотидного разнообразия характеризуются популяции Ls5 и Ls2 (h=0,078 и 0,075 соответственно), а наименее сбалансированной по данному типу маркеров (h=0,258) оказалась популяция Ls8 (табл. 1).

Для характеристики своеобразия генофондов большое значение имеет число уникальных аллелей (Un). Уникальные аллели, присутствующие только в одной из популяций и встречающиеся с заметной частотой (более 1 %) характеризуют уникальность генофонда на популяционном уровне. С использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК в популяциях Ls3, Ls5, Ls9 выявлено по одному уникальному, а в популяции Ls6 – 2 уникальных ISSR-маркера. Информативными для выявления уникальных аллелей были и SNP-маркеры. Уникальные SNPs обнаружены в восьми популяциях L. sibirica: в популяции Ls3 найдены 2 уникальных SNPs, а в популяции Ls7 – 5, в остальных выявлено по 1 уникальному SNP-маркеру. В среднем с наибольшей частотой SNPs встречались в популяции Ls5 (0,450), а с меньшей (0,130) – в популяции Ls4 (табл. 1).

Установленные при молекулярно-генетическом анализе параметры генетического разнообразия L. sibirica разделены на четыре группы (табл. 1). К первой (1) группе относятся «Основные показатели генетического разнообразия», вторую группу (2) параметров генетического разнообразия составляют показатели внутрипопуляционного разнообразия, третья группа (3) характеризует генетическую структуру и дифференциацию популяций (табл. 1). Важной группой параметров генетического разнообразия является четвертая (4), так как характеризует «специфику» генофонда. Высокие значения КГО популяции свидетельствуют о повышенном присутствии редких для региона исследований аллелей и соответственно специфичности ее генофонда, а популяции с минимальным значением КГО имеют минимальные частоты и число редких аллелей. Такие популяции характеризуются наиболее типичным или базовым генофондом [6]. При характеристике специфичности генофондов необходимо учитывать не только значения КГО, но также присутствие и число уникальных аллелей в популяции, так как наличие таких аллелей может указывать на особенности структуры генетического разнообразия популяций. Наибольшие значения КГО имеет популяция Ls5 (КГО=1,171), кроме того в ней обнаружены уникальные аллели, выявленные с помощью как ISSR-, так и SNP-маркеров (табл. 1). Эта популяция является самой западной и располагается на большом расстоянии от других изученных популяций, вероятно в связи с этим в ней сосредоточены нетипичные для региона исследований аллели, что может быть обусловлено историей расселения вида в регионе и формированием его ареала из различных популяционных систем. Вторым по величине КГО и, соответственно, нетипичными аллелями обладает девятая популяция L. sibirica (КГО=0,939). Она расположена в предгорной области восточного макро-склона вблизи границы Среднего и Южного Урала и является самой южной из изученных популяций. В ней также обнаружены уникальные аллели, выявленные с помощью обоих типов ДНК-маркеров.

Таблица 1

Оценка состояния генофондов популяций L. sibirica

Популя-

ция

1. Основные показатели генетического разнообразия

2. Внутрипопуля-

ционное разнообразие

3. Генетическая структура и дифференциация

4. Специфика

генофондов

P95

HE

I

μ

Hd

hISSR

hSNP

UnISSR/SNP

КГО

Ls1

0,772

0,172

0,271

1,639

0,872

0,181

0,154

0/1

0,935

Ls2

0,806

0,182

0,287

1,664

0,871

0,168

0,075

0/1

0,925

Ls3

0,806

0,189

0,298

1,698

0,887

0,151

0,111

1/2

0,760

Ls4

0,821

0,225

0,313

1,703

0,857

0,148

0,117

0/0

0,587

Ls5

0,871

0,223

0,338

1,774

0,836

0,113

0,078

1/1

1,171

Ls6

0,816

0,213

0,328

1,714

0,859

0,143

0,091

2/1

0,776

Ls7

0,741

0,168

0,258

1,626

0,883

0,187

0,160

0/5

0,703

Ls8

0,768

0,200

0,305

1,664

0,636

0,168

0,258

0/1

0,930

Ls9

0,872

0,242

0,369

1,738

0,911

0,131

0,126

1/1

0,939

Примечание: P95 – доля полиморфных локусов; HE – ожидаемая гетерозиготность; I – информационный индекс Шеннона; μ – показатель внутрипопуляционного разнообразия; Hd – общее гаплотипическое разнообразие; hISSR – доля редких морф, рассчитанная на основании ISSR-маркирования; hSNP – доля редких морф, рассчитанная на основании SNP-маркирования; UnISSR/SNP – число уникальных аллелей, выявленных с помощью ISSR- и SNP-маркеров; КГО – коэффициент генетической оригинальности.

Наименьшее значение КГО имеет четвертая популяция (КГО=0,587), располагающаяся на севере Пермского края почти в центре района среднетаежных лесов, занимающих здесь огромные территории с непрерывным ареалом и практически не затронутые человеческой деятельностью (табл. 1). Вероятно, вследствие этого популяция Ls4 характеризуется наиболее типичным генофондом. Уникальные маркеры в данной популяции не обнаружены. Таким образом, для ранжирования генофондов по степени специфичности предлагаются следующие интервалы: с КГО от 0,580 до 0,930 – типичный; с КГО от 0,930 и выше – специфичный, но при этом необходимо также учитывать наличие уникальных аллелей. Так, в популяции Ls7 с КГО=0,703 выявлено наибольшее число (5) уникальных (то есть специфичных) аллелей, выявленных с помощью SNP-маркеров, поэтому генофонд данной популяции может быть отнесен к специфичным (табл. 1).

Для оценки состояния генофондов популяций все избранные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную на примере изученных природных популяций L. sibirica шкалу оценки состояния генофондов. На основании данной шкалы установлено, что в высокой степени удовлетворительное состояние (Ia) характерно для генофондов популяций Ls5 и Ls9 (табл. 2); в средней степени удовлетворительном (Iб) состоянии находятся генофонды шести популяций L. sibirica (табл. 2), а в одной популяции наблюдается тенденция к обеднению генофонда (Ls7), его состояние оценено как средняя степень обеднения – IIa (табл. 2, рисунок).

Таблица 2

Шкала оценки состояния генофондов популяций L. sibirica

Состояние генофонда

P95

HE

I

μ

Hd

hISSR/SNP

Un1

КГО

I Удовлетворительное

>0,750

>0,170

>0,300

>1,650

>0,750

<0,200

>3

>0,900

высокая степень

>0,820

>0,220

>0,350

>1,700

>0,870

<0,150

>1,100

средняя степень

0,750-0,820

0,170-0,220

0,300-0,350

1,650-1,700

0,750-0,870

0,200-0,150

0,900-1,100

II Обеднение генофонда

0,550-0,750

0,100-0,170

0,200-0,300

1,500-1,650

0,550-0,750

0,300-0,200

1-2

0,500-0,900

IIа

средняя степень

0,650-0,750

0,130-0,170

0,250-0,300

1,550-1,650

0,650-0,750

0,250-0,200

0,700-0,900

IIб

сильная степень

0,550-0,650

0,100-0,130

0,200-0,250

1,500-1,550

0,550-0,650

0,300-0,250

0,500-0,700

III Деградация генофонда

<0,550

<0,100

<0,250

<1,500

<0,550

>0,300

<1

<0,500

IIIа

средняя степень

0,450-0,550

0,050-0,100

0,200-0,250

1,300-1,500

0,450-0,550

0,350-0,300

 

0,400-0,500

IIIб

сильная степень

<0,450

<0,050

<0,200

<1,500

<0,450

>0,350

<0,400

Примечание: P95 – доля полиморфных локусов; HE – ожидаемая гетерозиготность; I – информационный индекс Шеннона; Hd – общее гаплотипическое разнообразие; μ – показатель внутрипопуляционного разнообразия hISSR/SNP – доля редких морф, рассчитанная на основании ISSR- и SNP-маркирования; Un1 – общее число уникальных аллелей, выявленных с помощью ISSR- и SNP-маркеров; КГО – коэффициент генетической оригинальности.

С целью сохранения генофонда ценного ресурсного вида растений L. sibirica рекомендуется отбирать как популяции с типичными (базовыми) генофондами, так и популяции, обладающие специфическими особенностями генофондов, являющиеся резервом генетической изменчивости.

Оценка состояния генофондов на примере двух популяций L. sibirica; P95, HE, I, Hd, μ, hISSR, hSNP, UnISSR, UnSNP, КГО – показатели генетического разнообразия; справа – шкала оценки состояния генофондов

Для отбора в качестве объектов сохранения могут быть рекомендованы популяции со специфическими генофондами, обладающие высоким уровнем генетического разнообразия. Например, такие как популяции Ls5 и Ls10, характеризующиеся высокими значениями КГО и наибольшими показателями генетического разнообразия. Кроме того, популяция Ls7, для которой характерно в целом обедненное состояние генофонда, имеет наибольшее число уникальных SNPs-маркеров и высокий показатель гаплотипического разнообразия, поэтому может быть рекомендована для отбора в качестве резерва генетической изменчивости на нуклеотидном уровне при сохранении генофонда вида (рисунок). Для сохранения базовых генофондов лиственницы сибирской предлагается популяция Ls4, для которой характерно в целом в средней степени удовлетворительное состояние генофонда, отсутствие уникальных маркеров и сбалансированная генетическая структура. Так же типичным генофондом обладает популяция Ls2. Данная популяция характеризуется высоким уровнем генетической изменчивости и внутрипопуляционного разнообразия, доля редких морф (hISSR=0,168; hSNP=0,075) свидетельствует о практически ненарушенной генетической структуре. Она находится на территории заповедника «Вишерский» на высоте около 800 метров над уровнем моря и поэтому может быть использована для сохранения генофонда L. sibirica в горах.

Заключение

Таким образом, на основании данных о генетическом разнообразии, полученных с помощью двух типов молекулярных маркеров, установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды восьми изученных популяций, а в одной популяции (Ls7) отмечены признаки обеднения генофонда. Наибольшие значения коэффициента генетической оригинальности (КГО) как интегрального показателя популяционного разнообразия установлены в популяциях Ls5 и Ls10. Для отбора в качестве объектов сохранения генофондов рекомендуются популяции с типичными и специфическими генофондами. Изучение генетической изменчивости природных популяций древесных растений и оценка состояния их генофондов могут быть использованы для составления генетически обоснованных программ по сохранению, восстановлению и рациональному использованию лесных генетических ресурсов.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «УМНИК» Фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (2013–2015 гг.).